Trizol Invitrogen提取RNA和DNA介绍
2019-01-21
TRIzol提取RNA和DNA简要说明
准备试剂:TRIzol氯仿100%异丙醇%乙醇无RNase的水handy pestle
操作步骤:RNA操作在冰上进行
1、每50~100mg组织加入1ml TRIzol ,handy pestle匀浆RNALater保存的组织,(其实组织50mg提出的RNA大大富余)
2、将匀浆样品在室温(15~30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3、每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,用手剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
4、4℃12,000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的约50%。
5、用200ul的枪2枪把水相转移到新管中(样本足够因此少抽以防止DNA污染)。
6、1mlTRIzol加入0.5ml100%异丙醇,颠倒混匀,室温放置10分钟。
7、4℃12,000×g离心10分钟,移去上清,之后可以看到RNA沉淀。
8、1ml TRIzol至少加1ml 80%乙醇。(-20°放一年) 10、vortex混匀,4℃下7500×g离心5分钟,弃上清,也可见沉淀。
9、室温放置干燥RNA沉淀,大约5~10分钟即可.加入无RNase的水(乳腺癌100mg样本加50ul浓度大约为2ug/ul),用枪头吸打几次,稍微离心,55~60℃放置10分钟使RNA溶解。可-80℃保存一段时间,最好马上逆转录。
10、260比280是1.8-2.1(低可能是污染,也可能测时候的问题)产量公式:260×稀释倍数×40=ug/ml DNA的分离准备试剂:乙醇0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇) 75%乙醇8mM NaOH 操作步骤: 样品加氯仿分层后,移去上层水相, 1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀,颠倒混匀,室温放置3分钟 4℃2000×g离心5分钟。 去上清,用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠,室温放置30分钟, 4℃2000×g离心5分钟,弃上清 (大于200ug的DNA重复一次1-3步骤)。 1ml TRIzol加入1.~2 ml75%乙醇,室温放置10~20分钟不时颠倒混合4℃2000×g离心5分钟, 弃上清。 室温放置晾干DNA 5~15分钟,用8mM NaOH 300l8mMNaOH溶解从1mg组织可能1-4ugDNA。溶解DNA后可用HEPES调节pH。 、DNA中可能包含一些胶状不溶物可>1000×g离心10分钟除去。 将溶液放入新管中。
准备试剂:TRIzol氯仿100%异丙醇%乙醇无RNase的水handy pestle
操作步骤:RNA操作在冰上进行
1、每50~100mg组织加入1ml TRIzol ,handy pestle匀浆RNALater保存的组织,(其实组织50mg提出的RNA大大富余)
2、将匀浆样品在室温(15~30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3、每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,用手剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
4、4℃12,000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的约50%。
5、用200ul的枪2枪把水相转移到新管中(样本足够因此少抽以防止DNA污染)。
6、1mlTRIzol加入0.5ml100%异丙醇,颠倒混匀,室温放置10分钟。
7、4℃12,000×g离心10分钟,移去上清,之后可以看到RNA沉淀。
8、1ml TRIzol至少加1ml 80%乙醇。(-20°放一年) 10、vortex混匀,4℃下7500×g离心5分钟,弃上清,也可见沉淀。
9、室温放置干燥RNA沉淀,大约5~10分钟即可.加入无RNase的水(乳腺癌100mg样本加50ul浓度大约为2ug/ul),用枪头吸打几次,稍微离心,55~60℃放置10分钟使RNA溶解。可-80℃保存一段时间,最好马上逆转录。
10、260比280是1.8-2.1(低可能是污染,也可能测时候的问题)产量公式:260×稀释倍数×40=ug/ml DNA的分离准备试剂:乙醇0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇) 75%乙醇8mM NaOH 操作步骤: 样品加氯仿分层后,移去上层水相, 1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀,颠倒混匀,室温放置3分钟 4℃2000×g离心5分钟。 去上清,用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠,室温放置30分钟, 4℃2000×g离心5分钟,弃上清 (大于200ug的DNA重复一次1-3步骤)。 1ml TRIzol加入1.~2 ml75%乙醇,室温放置10~20分钟不时颠倒混合4℃2000×g离心5分钟, 弃上清。 室温放置晾干DNA 5~15分钟,用8mM NaOH 300l8mMNaOH溶解从1mg组织可能1-4ugDNA。溶解DNA后可用HEPES调节pH。 、DNA中可能包含一些胶状不溶物可>1000×g离心10分钟除去。 将溶液放入新管中。