脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，主要的发酵微生物有黑曲霉，假丝酵母等等。适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，一般不同来源的脂肪酶特性也不一样并且在理论研究方面也具有重要的意义。
脂肪酶的分离纯化
酶的分离纯化是将酶从细胞中或者其他酶原料中提取出来，在于杂质分开、从而获得符合研究和使用要求的酶制品过程。
主要包括：细胞破碎、酶的提取、离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩干燥和结晶等。
酶的纯化选择：首先考虑其用途，实验室研究和临床治疗中所使用的为高纯度的酶；而工业用途的酶对纯度的要求不是很严格，但是一定纯度的酶制剂不仅可以保证催化反应快速有效的进行，而且也降低了反应的复杂性，增加了反应的可预测性。
大部分微生物脂肪酶为胞外酶，发酵后通过离心或者抽滤出菌体，得到的含酶上清液通过硫酸铵或有机溶液萃取浓缩，出去部分蛋白质和糖类，然后再用层析法进一步纯化。除了少部分基因工程菌能够高效表达功能性脂肪酶，绝大部分野生型菌株都要联合两种以上的层析方法纯化才能获得预期纯度的蛋白质。