碱性磷酸酶提取分离纯化
2019-03-18
碱性磷酸酶、广泛存在于微生物界和动物界,碱性磷酸酶几乎能催化所有磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。他也可以催化磷酸基团的转移反应。磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
碱性磷酸酶(AKP或ALP)是一种底物特异性较低,在碱性条件下能水解多重磷酸单酯化合物的酶,需要镁和锰离子为激活剂,AKP具有磷酸基团转移活性能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有氢基的接受体上,如磷酸基团的接受体是水,则其作用就是水解。•KP最适合PH范围为8.6-10,动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝,小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化,也可以采用基因工程表达的方式获得:将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体,转入宿主菌中进行重组表达,从表达菌提取,并进行动力学分析。
分离纯化:
1、取1g新鲜的兔肝至于70℃冰箱内进行预先冷冻处理后取出,至于玻璃匀浆器内。加入0.01mo1/L醋酸镁、0.01mo1/L醋酸钠混合溶液3mL,充分研磨至糊状。
2、将匀浆液倒入刻度离心管中,使用4ml、0.01mo1/L醋酸镁、0.01mo1/L醋酸钠混合溶液冲洗研磨器具,将冲洗液一并转入离心管内,离心管一定要置于冰块保护下,以后各个步骤也要注意保持低温。
3、加1mL正丁醇与匀浆原液中,使用玻璃棒充分搅匀,放置冰浴中2min。使用滤纸过滤,过滤置于另一支刻度离心管中,过滤液也需要冰块保护。
4、滤液中加入等体积的冷丙酮,立即混匀后离心、2000r/min5min,弃去上清液,在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁2mL用玻璃棒充分搅拌使其溶解。
5、向沉淀中加入4.0mL0.5mol/L醋酸镁溶液,充分搅拌使其溶解。同时记录悬液体积向上清液中加入95%冷乙醇,使乙醇浓度到达60%,混匀后立刻离心5min(2500r/min),弃上清液。
向沉淀中加入4.0ml 0.01mol/L醋酸镁一0.01mol/L酸钠溶液,充分搅拌,使其溶解。向上余悬液中逐滴加入冷丙酮,使丙酮浓度33%,混匀后离心5min(2000r/min),弃去沉淀物。
碱性磷酸酶(AKP或ALP)是一种底物特异性较低,在碱性条件下能水解多重磷酸单酯化合物的酶,需要镁和锰离子为激活剂,AKP具有磷酸基团转移活性能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有氢基的接受体上,如磷酸基团的接受体是水,则其作用就是水解。•KP最适合PH范围为8.6-10,动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝,小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化,也可以采用基因工程表达的方式获得:将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体,转入宿主菌中进行重组表达,从表达菌提取,并进行动力学分析。
分离纯化:
1、取1g新鲜的兔肝至于70℃冰箱内进行预先冷冻处理后取出,至于玻璃匀浆器内。加入0.01mo1/L醋酸镁、0.01mo1/L醋酸钠混合溶液3mL,充分研磨至糊状。
2、将匀浆液倒入刻度离心管中,使用4ml、0.01mo1/L醋酸镁、0.01mo1/L醋酸钠混合溶液冲洗研磨器具,将冲洗液一并转入离心管内,离心管一定要置于冰块保护下,以后各个步骤也要注意保持低温。
3、加1mL正丁醇与匀浆原液中,使用玻璃棒充分搅匀,放置冰浴中2min。使用滤纸过滤,过滤置于另一支刻度离心管中,过滤液也需要冰块保护。
4、滤液中加入等体积的冷丙酮,立即混匀后离心、2000r/min5min,弃去上清液,在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁2mL用玻璃棒充分搅拌使其溶解。
5、向沉淀中加入4.0mL0.5mol/L醋酸镁溶液,充分搅拌使其溶解。同时记录悬液体积向上清液中加入95%冷乙醇,使乙醇浓度到达60%,混匀后立刻离心5min(2500r/min),弃上清液。
向沉淀中加入4.0ml 0.01mol/L醋酸镁一0.01mol/L酸钠溶液,充分搅拌,使其溶解。向上余悬液中逐滴加入冷丙酮,使丙酮浓度33%,混匀后离心5min(2000r/min),弃去沉淀物。