水飞蓟素检测分析方法
水飞蓟素是抗氧化剂,从一种名为乳蓟(Milk Thistle)植物提炼而成。水飞蓟素能稳定肝细胞膜,维持肝细胞之完整性,使毒素无法穿透破坏肝脏,并能加速合成肝脏细胞的DNA(去氧核糖核酸)。
水飞蓟素检测分析:(仅供参考)
1. 分光光度法测定水飞蓟素的含量精密称取本品粉末适量, 置50ml容量瓶中, 加入无水乙醇40ml溶解后, 定容, 摇匀, 精密吸取5ml置100ml容量瓶中, 加入无水乙醇至刻度, 摇匀, 同时做一空白对照。紫外分光光度计在288nm处测定吸光度。
2. 分光光度法测定水飞蓟素的含量精密称取提取物精制品约250mg, 置50ml容量瓶中, 加入适量甲醇溶解后, 定容至50ml, 摇匀, 溶液即为被测液。取1ml被测液于10ml容量瓶中, 加入2ml 2, 4-二硝基苯肼试剂, 摇匀, 塞上塞子,在50℃时加热50分钟, 冷却, 加入氢氧化钾的甲醇液至刻度, 摇匀, 静置2分钟。取1ml此液于离心试管中, 加入20ml甲醇, 摇匀, 离心。将红棕色上清液倒入50ml的容量瓶中, 残渣再加入20ml甲醇离心, 合并上清液, 用甲醇稀释至刻度。精密吸取1ml甲醇置10ml容量瓶中, “加入2ml 2, 4-二硝基苯肼试剂”同法操作, 作为空白对照。以空白溶液为对照,在490nm处测定被测浓度的吸光度A值,以E=537计算水飞蓟素的含量。3.分光光度法测定水飞蓟素的含量标准溶液的制备:精密称取水飞蓟宾标准品25mg,置于5ml容量瓶,加甲醇溶解并定容至刻度,即得浓度为5mg/ml的标准品溶液。样品溶液的制备:称250mg的水飞蓟素至50ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,备用。显色溶液的制:2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine)试液:称此试剂500mg置于50ml容量瓶中,加H2SO41ml,用甲醇稀释至刻度即得。10%KOH溶液:称10gKOH置于100ml容量瓶中。加水30ml,用甲醇稀释至刻度即得。测定法:取标准溶液、样品溶液、甲醇各1 ml分别置10ml容量瓶中,并分别加入2ml的2, 4二硝基苯肼试液,三个容量瓶在水浴中50~55℃下反应50min,用自来水快速冷却后,加KOH溶液至刻度,分别吸取上述三种反应后的溶液1 ml于10ml的具塞试管中,加甲醇10ml混匀,离心10min,上清液分别倾于50ml容量瓶中,离心沉淀再加甲醇10ml混匀,离心,上清液再分别倾于同一50ml容量瓶中,并重复一次,将三个50ml容量瓶均加甲醇至刻度。摇匀,于紫外分光光度计490nm处测定吸光度值。A1:样品吸光值;A2:标准品吸光值;W1:样品取样量(g);W2:标准品取样量(g);V1:样品稀释体积;V2:标准品稀释体积4.分光光度法测定水飞蓟素的含量:将约1.0g的2、4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine),真空干燥8小时,精确称重,溶于2ml的硫酸中,临时配置该溶液。标准溶液的制备:将精确称重的USP水飞蓟宾标准品溶于甲醇中,制成约2.0mg/ml浓度的溶液。样品液制备:将约5.0g的水飞蓟精细粉末精确称重,置于一个提取套管,用小棉球塞住。将提取套管与连有连续提取装置、含150ml的己烷250ml的圆底烧瓶连接,套管上加热4小时,然后,将含己烷的圆底烧瓶与提取装置分离,弃去溶剂,干燥去除残余溶剂。再将提取套管与连有可连续热提取装置、含100ml乙酸乙酯的250ml的圆底烧瓶连接,套管上加热回流8小时,减压条件下,40℃旋转蒸发仪上挥发溶剂至干。将残余物用25ml甲醇溶解,定量过滤至一50ml的烧瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。
检测: 分别将1.0ml的标准制备液和样品制备液加入2个琥珀色的10ml烧瓶中, 准确标记, 分别加入2ml的试液, 混合。塞上瓶塞, 保持在50±1℃, 缓慢搅拌50分钟。冷却, 用甲醇稀释溶液至刻度, 混合。分别取上述溶液2.0ml, 移至一100ml烧瓶中, 并加入3.0ml的羟化四氢铵甲醇溶液 (25%) [注意: 羟化四氢铵临时配制, 透明、无色溶液]。用甲醇稀释至刻度, 使烧瓶静置30分钟。同时在1cm吸收池、490nm处测定标准制备液和样品制备液的吸收度, 甲醇溶液作空白, 并用以下公式计算水飞蓟宾和水飞蓟素的百分含量:5000(C/W) (Au/As)C: 为标准溶液中水飞蓟宾的浓度 (mg/ml); W: 样品制备液中所用干燥水飞蓟的重量 (mg); Au和As分别为样品制备液和标准制备液的吸收度。5. HPLC法测定水飞蓟素的含量 (INA法)色谱条件: 柱: YMC-Mark ODS C18 5u 4.6×150mm(或Phenomenex Luna C18 5u 4.6×150mm); 流动相: A液: 5ml磷酸加入995ml甲醇-水溶液(20:80), B液: 5ml磷酸加入995ml甲醇-水溶液 (80:20), 按表7-1程序洗脱; 流速: 1.0ml/min; 柱温: 40C; 检测波长: 288nm; 进样量: 10μl。标准品溶液的制备: 精密称取真空干燥的水飞蓟宾10.00mg, 用甲醇溶解, 并定容至25ml, 即为对照品溶液。按1:2, 1:10, 1:25, 1:50比例稀释。供试品溶液的制备: 药材 精密称取约10g药材细粉, 用100ml己烷于索氏提取器在水浴上提取4小时至色淡 (或无色), 提取液弃, 药渣挥干溶剂, 残渣加入90ml甲醇置水浴上回流提取8小时, 提取液冷却后定量至100ml, 稀释25倍, 过滤, 滤液即为供试品溶液。提取物 精密称取提取物粉末70mg(精确至0.1mg), 加70ml甲醇超声提取20分钟,冷却, 定容至100ml, 滤过。测定法: 对照品溶液、提取溶剂、供试品溶液分别进样, 见图7-2。以标准品峰面积对浓度绘制曲线, 水飞蓟宾A、B的线性相关系数应不小于0.999, 分离度不小于1.8。6. HPLC法测定水飞蓟提取物中SilibininA、B的含量色谱条件:预柱:2cm Bondapak C18/37-50Micron;柱:25cm RP18,5μm;流动相及洗脱程序见表7-3;流速:1.0ml/min;检测波长:288nm;进样量:10μl。7. 气相色谱法 (顶空进样) 测定水飞蓟提取物中己烷和乙醇的残留量内标溶液: 精密称取250mg戊烷, 加二甲苯定容于10ml量瓶。校正液: 精密称取100mg乙醇、己烷、戊烷, 加二甲苯定容于10ml量瓶。移取10μl溶液至顶空进样瓶, 密封。供试液: 精密称取0.1~0.5g干提取物, 置一个顶空进样瓶, 加10μl内标液(相当于250mg戊烷), 密封。顶空进样参数: 温度: 110℃; 温度调节时间: 10分钟; 压力调节时间: 1分钟。色谱条件: 柱: DB-1硅胶毛细管, 30m×0.25mm内径, 厚0.1μm。炉温: 40℃保持7分钟; 然后12℃/分钟, 至180℃; 保持0.5分钟; 30℃/分钟至280℃, 然后保持10分钟。进样器: 150℃; 检测器: FID250℃; 载气: 氮气(5psi); 分流比: 1:5; 积分停止时间: 25分钟。8. 气相色谱法测定水飞蓟提取物中丙酮残留量内标溶液: 精密称取丙酮, 加水定容至6.00mg/ml。