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2019-01-10
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)﹐是一种能够与DNA中大部分A,T碱基相互结合的荧光染料﹐常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜﹐它可以用于活细胞和固定细胞的染色。
在荧光显微镜观察下,DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。当DAPI与双股DNA结合时,最大吸收波长为358nm,最大发射波长为461nm,其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合,但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果,其发散光的波长范围约在400nm左右。
DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合,因此DAPI对生物体而言,也被视为一种毒性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。
DAPI可用于固定细胞染色,但是因为活细胞染色对DAPI浓度有严格要求,它很少被用于活细胞染色。DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合,因此DAPI对生物体而言,也被视为一种毒性物质与致癌物。然而在MSDS中它被标记为无毒。尽管DAPI没有显现出对E.colii的诱变性,它在机器制造商提供的信息上被认为是一种DNA诱变剂。由于DAPI可以掺入DNA螺旋中,它很有可能有底层的DNA诱变性,因此应小心配置和使用DAPI。
染色原理:
DAPI 为一种荧光染料,可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用,可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光,和EB相比,对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞,荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) ,且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟,在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。
1、 正常的烟草细胞核:核形完整,染色质均匀。
2、 染色质固缩,向外周聚集,形成周边化。
3、 染色质进一步固缩,形成很多颗粒物质。
4、 细胞核破裂形成碎片,核解体。
染色步骤:
在细胞移植前,将DAPI 以一定的浓度加入培养基中,与细胞共同孵育过夜,用PBS 缓冲液漂洗至少6 次以洗掉未结合的DAPI,在用酶消化后离心收集细胞,加入DMEM 培养基制成细胞悬液以备用。
存储条件:-20℃避光保存
注意事项:
1、DAPI强烈致癌,操作时要戴上手套。
2、贮存液用70%酒精配制,浓度100 µg/ml,可用黑纸包住,长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释,最终浓度100 ng/ml。
3、DAPI是非常优秀的DNA染料,固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。
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